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高丽参提取物的抗氧化作用研究

文:罗巅辉

摘要:采用乙醇回流提取,热水煮提和稀碱提取分别从高丽参中提取出醇溶性提取物、水溶性提取物和 稀碱提取物.利用超氧阴离子清除实验、羟自由基清除实验和邻苯三酚自氧化抑制实验研究3种提取物的抗氧化活性.结果表明,热水提取物有最强的羟自由基清除能力,且高于维生素c的清除能力.稀碱提取物在低浓度时与维生素c相比有更强的超氧阴离子清除作用. 

高丽参为五加科植物人参的干燥根,它主产于我国东北地区、朝鲜和日本,俗称别直参.高丽参的应用在我国有着悠久的历史,尤其在妇产科运用上有独特疗效.功效为补五脏、安精神、止惊悸、除邪气、明目、开 心益智,久服轻身延年,自古迄今作为珍贵补品,因此《神农本草经》将它列为上品. 

对于高丽参提取物的研究未见任何报道。为了合理利用高丽参资源并寻找新的高丽参有效成分,本文对其乙醇提取物、水溶性提取物和碱溶性提物的抗氧化活性进行研究.

1、材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

1.1.1材料高丽参:购于辽宁丹东;1.1.2试剂与仪器氯化硝基氮蓝四唑(NBT),吩嗪硫酸甲酯(PMs),脱氧核糖,硫代巴比妥酸(,IBA)及还 原型辅酶I(NADH·2Na);硫酸亚铁、维生素c、双氧水、三氯乙酸、邻苯三酚(焦性没食子酸);分析纯. DK.S2-4型电热恒温水浴锅;LD4—2离心机;sHB一Ⅲ循 环水式多用真空泵;721可见分光光度计。 

1.2实验方法

1.2.1 高丽参活性成分的乙醇提取准确称取高丽参200 g,加入一定体积80%(体积分数)的乙醇,在50 ℃水浴中回流提取6 h,问隙搅拌.提取完毕,过滤,离心分离提取液,残渣再用相同体积和浓度的乙醇提取1 次,合并提取液,离心分离,上清液旋转蒸干,得乙醇提取物.残渣烘干用于热水提取. 

1.2.2高丽参活性成分的热水提取将上述残渣100 g加入3 000 mL的蒸馏水,封口,在80 c|C恒温水浴下 提取3 h,过滤,滤渣烘干留作下一步提取用.将滤液合并,60℃减压旋转蒸发浓缩至小体积后离心,弃去沉 淀物,上清液用4倍体积无水乙醇进行醇沉,即乙醇体积分数为80%,然后放置4℃冰箱中醇沉10 h以上. 次日离心10 min(3 000 r/min),取沉淀,常规干燥得热水提取物. 

1.2.3高丽参活性成分的稀碱提取 将热水浸提过的残渣,按照料液比l:10(∥mL)加入0.5 m0L/L NaoH溶液,封口,在4℃条件下提取10 h,离心,上清液用1 m01/L的醋酸中和至pH=7.0,加入唾液淀粉酶,37℃ 保温去除淀粉,每隔3 h补加一次唾液淀粉酶,直至碘检验颜色不变蓝为止,离心弃沉淀,将上清液浓缩,加4 倍体积的无水乙醇醇沉10 h,沉淀经干燥得稀碱提取物.

1.2.4超氧阴离子清除能力的测定参照Robak的方法l2|,并改进.将样品配制成浓度为o(对照),0.78, 1.56,3.125,6.25,12.5,25,50和100叫mL的水溶液,取O.1 mL分别加入1 mL含557舯oL/L NADH的16 mmoL/L Tds.HCl(pH8.0),l mL含45肚mol/L PMS的16 mmol/L Tris.HCl(pH 8.0),以及1Ⅱ1IJ含108肛nlol/L NBT的16 mmol/L Ths Hcl(pH 8.0).25℃温浴5 min,取出在560 nIll下测吸光值.实验重复3次,根据下式 计算超氧阴离子清除率:清除率=(1一样品管A560/对照管A560)×100%.

1.2.5羟自由基清除作用的测定 以Ghiselli等的方法为基础并改进o 3;,即将样品酣制成浓度为0(对照), 0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2,6.3,12.5,25和50 m∥HlL的水溶液,取0.1 n1L分别加入0.6 n1L反应缓冲液(含 2.67 mmoL/L脱氧核糖和0.13 m瑚ol/L E肌~的o.2 moL/L pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液),o.4 rnrn01/L硫酸亚 铁0.2 n1L,2.O蝴l/L抗坏血酸0.05 mL,以及20㈣L/L的H,0,0.05 mL,37℃下温浴15 min,取出后加入 1%硫代巴比妥酸1 n正和2%三氯乙酸l mL,沸水浴15 min,取出立即放在冰上冷却,532 nm测吸光值.清除 率=(1一样品管A532/对照管A锄)×100%.

1.2.6对邻苯三酚自氧化的抑制 测定参照Marklund的方法,并改进.配制质量浓度分别为o(对照),5, 10,20,40,60和80 m∥IllL的样品液.取0.1 n1L样品液与含1 mmol/L EDTA的2.8 mL 0.05 n10l/L豫s-HCl缓 冲溶液(pH8.0)以及6ⅡⅡnoL/L邻苯三酚0.2 mL混合,室温下剧烈振荡.混合物在325 nm下每隔30 s测一次 吸光值,连续测4 min.计算每分钟的吸光值,即斜率.抑制率=(1一样品斜率A325/对照斜率A325)×100%.

1.2.7提取物活性成分定性检测 皂甙类成分采用氯仿.浓硫酸反应和三氯醋酸反应L5o;黄酮类成分采用 盐酸.镁粉反应拍1;生物碱类的检测利用碘.碘化钾沉淀反应[5,60;多糖采用苯酚硫酸法门o;葸醌类化合物利用 浓硫酸.乙醚反应检测。

2、结果与分析  2.1提取物体外清除超氧阴离子的作用 超氧阴离子是机体代谢过程中产生的一种活性氧 自由基.在NBT光化还原产生超氧阴离子的体系中. 专如图1所示,高丽参热水提取物和稀碱提取物对超氧 鎏6U 阴离子均有一定清除作用.稀碱提取物对超氧阴离子 8 40 的清除作用较强,与V,相比,此提取物在反应体系含 20 量小于2.5 mg时,对超氧阴离子的清除率远远高于V。 o 的清除率,随反应体系中提取物添加量的增加,稀碱提

n078叭56吼3凝毒套釜/毒5 5 10取物对超氧阴离子的抑制率趋于平稳,而V,对超氧阴 离子的清除率的抑制率逐渐增大且超过热水提取物.高丽参提取物的超氧阴离子清除作用 热水提取物对超氧阴离子的清除作用在加入量到达1.25 mg时才有较明显的清除作用,但总体清除率要小于稀碱提取物.乙醇提取物对超氧阴离子基本没有清除作用.


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稀碱提取物的加入量在O.078~2.5 nlg时,对超氧阴离子的清除率介于7.86%和50.18%之间.维生素 c在此加入量范围内对超氧阴离子的清除作用是0.相比之下,稀碱提取可能有更强的超氧阴离子清除作用.

2.2提取物体外清除羟自由基的作用 羟自由基(~OH)被认为是毒性最强的活性氧自由基,辐射损伤等物理、化学因子都会促进其形成,是 造成生物有机体过氧化损伤的主要因素,

从图2可以看出,高丽参热水提取物和稀碱提取物体外均有显著 的清除羟自由基的作用,整个反应体系含O.0l IIlg热水提取物或含0.08 mg稀碱提取物时,即显示清除羟自 由基的能力,随着提取物质量浓度的升高,清除作用也逐渐加强,呈现量效关系;相对V。而言,在反应体系含样品量0.0l~5 nlg之问,热水提取物显示较强的羟自由基清除活性,稀碱提物对羟自由基的清除作用结于 两者之问.乙醇提取物基本没有清除作用.热水提取物在用量o.ol~5mg时,对羟自由基的清除作用介于 7.79%和99.15%之间.稀碱提取物在此范围内的清除作用是o~61.35%.而维生素c对羟自由基的清除作 用在此范围内时是o~58.84%.这个结果证明,高丽参热说提取物和稀碱提取物均有较强的羟自由基清除 作用,并且可能比维生素c的羟自由基清除作用强. 

2.3提取物对邻苯三酚自氧化的抑制作用 邻苯三酚在碱性条件下能迅速发生自氧化反应,生成超氧阴离子和有色中间物,其反应速度依赖于自 氧化反应所产生的阴离子浓度,在4 rnin内阴离子生成量和中间产物较稳定,故可以用不同质量浓度的提取 物,测定它们对邻苯三酚自氧化速率的抑制作用,结果见图3.从图3可知高丽参的3种提取物均能清除邻 苯三酚自氧化反应所产生的活性氧,其抑制率随反应体系含提取物质量的增加而加大,在质量相同情况下, 热水提取物和稀碱提取物对邻苯三酚自氧化速率的抑制作用相当,且明显高于乙醇提取物的抑制作用,但3 种提取物对苯三酚自氧化速率的抑制作用均不如维生素c作用强.


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2.4高丽参提取物活性物质的定性检测 3种提取物的主要活性成分检测结果如表1.采 用热水煮提醇沉得到的提取物和碱提醇沉得到的提 取物均是水溶性成分,它们的有效活性成分可能主 要是多糖,在热水提取物中也有少量皂甙检出.而乙 醇提取物种主要含有皂甙成分.以上实验结果表明, 在抗氧化活性较强的热水提取物和稀碱提取物中主 要行使功能的活性成分最有可能是多糖.


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3结论 高丽参热水提取物和稀碱提取物均有较强的抗氧化作用,其中热水提取物对羟自由基的清除作用最 强,其次是稀碱提取物,同时两者的羟自由基清除能力均高于维生素C的清除能力.稀碱提取物对超氧阴离 子的清除能力与维生素C相比,在反应体系含样品量低于2.5 mg时稀碱提取物对超氧阴离子的清除能力较 强,但最大清除率只能达到50%。

左右.随样品含量的升高,维生素c的抑制率继续提高,而稀碱提取物对超 氧阴离子的抑制率趋于稳定.乙醇提取物对羟自由基和超氧阴离子均没有抑制活性.3种提取物对邻苯三酚 自氧化均有一定的抑制作用,热水提取物与稀碱提取物的抑制能力相当且高于乙醇提取物,但3种提取物均 不如维生素c对邻苯三酚自氧化的抑制作用强.对提取物活性物质检测结果表明,水提取物中主要活性成 分可能是多糖和皂甙,稀碱提取物中多糖可能是主要的活性成分。



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